了解霉菌形態(tài)，掌握微生物載玻片濕室培養(yǎng)方法。

實驗內(nèi)容

1．根霉假根的觀察。

2．霉菌載玻片濕室培養(yǎng)。

3．曲霉、青霉、根霉、毛霉形態(tài)觀察。

二、實驗材料和用具

產(chǎn)黃青霉(Penicfillium chrysogenum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑根霉(Rhizopus nigrians)、總狀毛霉(Mucor racemosus)等斜面菌種。

半固體PDA培養(yǎng)基、乳酸苯酚固定液、棉藍染色液、20%甘油;

透明膠帶、剪刀、培養(yǎng)皿、載玻片、口形玻棒擱架、蓋玻片、圓形濾紙片、細口滴管、鑷子、顯微鏡、接種環(huán)。

三、操作步驟

(一)霉菌的載玻片濕室培養(yǎng)

可4人合作，每人制作一霉菌的載玻片。

1．準備濕室 在培養(yǎng)皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一“冂”形載玻片擱架，在擱梁上放一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎，經(jīng)12l℃濕熱滅菌30min后，置60℃烘箱中烘干，備用。

2．接種 用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌孢子至濕室內(nèi)的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾下即可(務必記住接種的位置)。

3．加培養(yǎng)基 用無菌細口滴管吸取少量融化約60℃的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，培養(yǎng)基應滴得圓而薄，其直徑約為0.5cm(滴加量一般以l/2小滴為宜)。

4．加蓋玻片 在培養(yǎng)基未徹底凝固前．用無菌鑷子將皿內(nèi)蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當接近，但不能壓扁，否則不透氣。

5．倒保濕劑 每皿倒大約3mL 20%的無菌甘油，使皿內(nèi)的濾紙完全潤濕，以保持皿內(nèi)濕度，皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。此為制成的載玻片濕室，置28℃恒溫培養(yǎng)3～5d。

(二)黑根霉假根的培養(yǎng)

將融化的PDA培養(yǎng)基，冷卻至50℃倒入無菌平皿，其量約為平皿高度的1/2。冷凝后，用接種環(huán)沾取根霉孢子，在平板表面劃線接種。然后將平皿倒置，在皿蓋內(nèi)放一無菌載玻片，于28℃培養(yǎng)2～3d后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結構。

(三)鏡檢觀察

1．濕室培養(yǎng)霉菌鏡檢載玻片 從培養(yǎng)16～20h開始，通過連續(xù)觀察，可了解孢子的萌發(fā)、菌絲體的生長分化和子實體的形成過程。將濕室內(nèi)的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態(tài)，重點觀察菌絲是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特點，曲霉的足細胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子繪圖。

2．粘片觀察 取一滴棉藍染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。

3．假根觀察 將培養(yǎng)根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。只要用低倍鏡就能觀察到假根及從根節(jié)上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個假根間的匍匐菌絲，觀察時注意調(diào)節(jié)焦距以看清各種構造。

4．制成永久裝片 把觀察到霉菌形態(tài)較清晰，完整的片子，制成標本作較長期保存。制備方法是，輕輕揭去蓋玻片，如果載玻片上有瓊脂，仔細挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，蓋上清潔蓋玻片，在蓋玻片四周滴加樹膠封固。

四、注意事項

載玻片濕室培養(yǎng)時，蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此有極小縫隙，一是為了通氣；二是使各部分結構平行排列，易于觀察。