DEAE-Sephadex A-50提取法純化多克隆抗體

發(fā)布日期：2013-09-22 來源：實驗室資訊網(wǎng)

核心提示：DEAE-Sephadex A-50（簡稱A-50）為弱堿性陰離子交換劑，經(jīng)過NaOH處理將Cl-型轉(zhuǎn)為OH-型后，可吸附酸性蛋白。1球蛋白屬中性蛋白，等

DEAE-Sephadex A-50（簡稱A-50）為弱堿性陰離子交換劑，經(jīng)過NaOH處理將Cl-型轉(zhuǎn)為OH-型后，可吸附酸性蛋白。γ1球蛋白屬中性蛋白，等電點為pH6.85～7.5，其余均屬酸性蛋白。在溶液為pH8.0時，酸性蛋白均被A-50 吸附。從而可分離純化IgG。

1. 批量吸附法

此法可在1天內(nèi)完成提取過程，純化前后樣品體積變化不大，所得IgG無變性現(xiàn)象，抗體效價亦無明顯降低。制品可達PAGE及免疫電泳純。適用于提純?nèi)恕⒀颉⑼玫妊逯械腎gG。

【材料和試劑】

（1）DEAE-Sephadex A-50。

（2）PB緩沖液：0.01mol/L，pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。

【操作步驟】

（1）A-50的預處理：稱取4～6g A-50懸浮于500～1000ml蒸餾水中，1h后傾去上層細粒。然后將A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液（60～100ml）中，攪拌后靜置30min，以蒸餾水洗至中性，再用0.1mol/L NaH2PO4同上操作過程處理，蒸餾水洗至中性。最后用0.01mol/L，pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（PB）平衡，減壓抽干，保存?zhèn)溆谩?/div>

（2）吸附提取：取15ml血清加等量0.01mol/L，pH6.5 PB稀釋至30ml（也可不稀釋），加入1/4體積濾干的DEAE-Sephadex A-50（相當于干重1g）混合。室溫（或4℃）浸泡1 h后過濾，收集濾液。再加入同樣體積的DEAE-Sephadex A-50重復上述處理過程共3次，亦可在血清內(nèi)加入過量DEAE-Sephadex A-50吸附處理一次。收集濾液合并，即為提純的IgG制品。或再透析去鹽，濃縮、凍干保存?zhèn)溆谩?/div>

2．A-50柱層析法

【材料和試劑】

（1）DEAE-Sephadex A-50。

（2）待純化標本：雜交瘤腹水或培養(yǎng)上清，免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。

（3）1.5×50cm 層析柱；透析袋及其他透析和層析所需的試劑和器材。

（4）PB緩沖液：0.1mol/L，pH7.4 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。

【操作步驟】

（1）A-50經(jīng)酸堿處理，平衡至中性后，浸泡于0.1mol/L，pH7.4 PB中，置4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/div>

（2）裝柱：同DE52。

（3）平衡：松開出水口螺旋夾，以PB平衡，控制流速為15滴/min，待洗脫液與流出液之pH值達到一致時，停止平衡。

（4）加樣、洗脫、收集與濃縮：基本上同DE52，以0.1mol/L PB洗脫。

用過的DEAE-Sephadex A-50可用0.5mol/L Na2HPO4洗脫回收。洗至流出液中無蛋白（OD280nm<0.04）后再用蒸餾水洗至中性，加入0.02％疊氮鈉于4℃保存?zhèn)溆谩?/div>