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三、微生物學驗證：生物指示劑挑戰試驗
核心目標：通過定量接種耐熱微生物孢子，驗證滅菌工藝的致死能力(即殺滅對數)。
1. 生物指示劑(BI)選擇
- 菌種：
- 需氧菌：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)孢子，耐熱性強(D值=1.53分鐘@121℃)，適用于濕熱滅菌驗證。
- 厭氧菌：嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)孢子，更常用(D值=1.53分鐘@121℃)，適用于密封罐體滅菌。
- 孢子濃度：每支BI含1×101×10 CFU( Colony Forming Unit，菌落形成單位)，確保滅菌后殺滅對數≥6(即存活概率<10)。
2. 布點與操作
- 布點原則：
- 覆蓋所有可能的滅菌死角：罐體底部排水口、進料管末端、空氣分布器、換熱器盤管死角、閥門盲端等。
- 每個關鍵位置放置2支BI(平行樣)，總布點數≥10個(小型罐)或≥20個(大型罐)。
- 操作步驟：
1. 將BI放入透氣性包裝(如無紡布)，避免直接接觸蒸汽導致孢子提前失活。
2. 滅菌前按布點圖固定BI，可通過支架或耐高溫膠帶定位。
3. 滅菌后取出BI，一支進行培養(培養基為胰蛋白胨大豆肉湯，5560℃培養4872小時)，另一支作為陽性對照(不滅菌直接培養)。
4. 結果判定：培養后觀察是否有渾濁或菌落生長，若所有BI均無菌生長，視為滅菌合格；若有陽性結果，需擴大驗證范圍并調整滅菌參數(如延長保溫時間、提高溫度)。
四、驗證周期與異常處理
1. 常規驗證周期
- 定期驗證：
- 新建/改造罐體：投產前需通過至少3次連續成功的驗證(物理+化學+微生物)。
- 正常生產：每612個月進行一次全面再驗證，每年至少一次微生物學驗證。
- 觸發再驗證場景：
- 更換滅菌工藝參數(如溫度從121℃調整為123℃)、罐體結構改造(如新增管道)、滅菌失敗事件(如染菌批次)后。
2. 異常情況處理
- 物理參數不達標：
- 檢查蒸汽供應(壓力、干度)、疏水閥是否堵塞、罐體保溫層破損等，修復后重新驗證。
- 化學/微生物驗證失敗：
- 分析滅菌死角原因(如管道坡度不足導致冷凝水滯留)，通過增加布點、調整滅菌程序(如預排水時間從5分鐘延長至10分鐘)或機械改造(如打磨焊縫消除死角)解決，直至驗證通過。
五、文件記錄與合規性
1. 驗證報告內容：
- 物理參數記錄(溫度-時間曲線、壓力波動圖)。
- 化學指示劑變色情況(附照片或圖示)。
- 生物指示劑培養結果(菌落計數表、陰性/陽性對照記錄)。
2. 合規性要求：
- 符合GMP(藥品生產質量管理規范)、FDA(美國食品藥品監督管理局)或ISO 13485(醫療器械質量管理體系)等標準，記錄需存檔至少35年。
- 若用于制藥行業，需通過PQ(性能確認)階段的微生物挑戰試驗，證明滅菌工藝的重現性和可靠性。
發酵罐滅菌效果驗證需遵循“科學布點、多方法交叉驗證、動態監控”原則，通過物理參數的精準控制、化學指示物的直觀反饋和生物指示劑的定量挑戰，確保滅菌無-死角、工藝穩定可靠。
實際操作中，可結合風險評估(如高附加值產品需提高驗證頻次)和數字化工具(如實時溫度云圖系統)提升驗證效-率，最終保障發酵過程的無菌環境。
核心目標：通過定量接種耐熱微生物孢子，驗證滅菌工藝的致死能力(即殺滅對數)。
1. 生物指示劑(BI)選擇
- 菌種：
- 需氧菌：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)孢子，耐熱性強(D值=1.53分鐘@121℃)，適用于濕熱滅菌驗證。
- 厭氧菌：嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)孢子，更常用(D值=1.53分鐘@121℃)，適用于密封罐體滅菌。
- 孢子濃度：每支BI含1×101×10 CFU( Colony Forming Unit，菌落形成單位)，確保滅菌后殺滅對數≥6(即存活概率<10)。
2. 布點與操作
- 布點原則：
- 覆蓋所有可能的滅菌死角：罐體底部排水口、進料管末端、空氣分布器、換熱器盤管死角、閥門盲端等。
- 每個關鍵位置放置2支BI(平行樣)，總布點數≥10個(小型罐)或≥20個(大型罐)。
- 操作步驟：
1. 將BI放入透氣性包裝(如無紡布)，避免直接接觸蒸汽導致孢子提前失活。
2. 滅菌前按布點圖固定BI，可通過支架或耐高溫膠帶定位。
3. 滅菌后取出BI，一支進行培養(培養基為胰蛋白胨大豆肉湯，5560℃培養4872小時)，另一支作為陽性對照(不滅菌直接培養)。
4. 結果判定：培養后觀察是否有渾濁或菌落生長，若所有BI均無菌生長，視為滅菌合格；若有陽性結果，需擴大驗證范圍并調整滅菌參數(如延長保溫時間、提高溫度)。
四、驗證周期與異常處理
1. 常規驗證周期
- 定期驗證：
- 新建/改造罐體：投產前需通過至少3次連續成功的驗證(物理+化學+微生物)。
- 正常生產：每612個月進行一次全面再驗證，每年至少一次微生物學驗證。
- 觸發再驗證場景：
- 更換滅菌工藝參數(如溫度從121℃調整為123℃)、罐體結構改造(如新增管道)、滅菌失敗事件(如染菌批次)后。
2. 異常情況處理
- 物理參數不達標：
- 檢查蒸汽供應(壓力、干度)、疏水閥是否堵塞、罐體保溫層破損等，修復后重新驗證。
- 化學/微生物驗證失敗：
- 分析滅菌死角原因(如管道坡度不足導致冷凝水滯留)，通過增加布點、調整滅菌程序(如預排水時間從5分鐘延長至10分鐘)或機械改造(如打磨焊縫消除死角)解決，直至驗證通過。
五、文件記錄與合規性
1. 驗證報告內容：
- 物理參數記錄(溫度-時間曲線、壓力波動圖)。
- 化學指示劑變色情況(附照片或圖示)。
- 生物指示劑培養結果(菌落計數表、陰性/陽性對照記錄)。
2. 合規性要求：
- 符合GMP(藥品生產質量管理規范)、FDA(美國食品藥品監督管理局)或ISO 13485(醫療器械質量管理體系)等標準，記錄需存檔至少35年。
- 若用于制藥行業，需通過PQ(性能確認)階段的微生物挑戰試驗，證明滅菌工藝的重現性和可靠性。
發酵罐滅菌效果驗證需遵循“科學布點、多方法交叉驗證、動態監控”原則，通過物理參數的精準控制、化學指示物的直觀反饋和生物指示劑的定量挑戰，確保滅菌無-死角、工藝穩定可靠。
實際操作中，可結合風險評估(如高附加值產品需提高驗證頻次)和數字化工具(如實時溫度云圖系統)提升驗證效-率，最終保障發酵過程的無菌環境。
