Ⅰ、將經熒光標記的抗體進行稀釋。如果濃度過高，背景會因為的非特異性的相互作用的增加而增加。

Ⅱ、在使用第一抗體之前，將樣品與過量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脫脂干奶酪，或來自于同一寄主的正常血清來作為標記的第二抗體。這個步驟通過阻斷第一抗體和細胞表面或胞內結構的非特異性的交互作用來降低背景。

Ⅲ、在使用第一抗體之后，將樣品與5%至10%的來自于同一寄主的正常血清作為標記的第二抗體一起培育。這個步驟會減少不必要的第二抗體與第一抗體、細胞表面或胞內結構之間的交互作用。

通過用來自于同樣的樣品的血清稀釋標記過的抗體可以略過此步驟。此步驟適用于很多方面，但有時候它也會導致已標記的第二抗體和正常血清中的免疫球蛋白的免疫復合體的形成。這種復合體會優先與一些細胞結構進行結合，或者它們最終會導致期望得到的抗體活性的丟失。

Ⅳ、使用F(ab’)2片段會使背景決定于第一或第二抗體與FC受體的全分子結合。大多數的第二抗體的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗體的F(ab’)2片段一般是不能利用或很難制作。因此，在NaN3存在的條件下，將新鮮組織或細胞與正常血清一起培育應選擇優先加入第一抗體。在此情況下，即使在隨后的步驟中用完所有的抗體分子，FC受體決定的背景影響已不再重要。

Ⅴ、在預料不到的已標記的抗體和其他一些內在的免疫球蛋白或加入實驗系統中的物質的交叉反應會引起背景影響。為了降低背景，在多重標記過程中，所有的已標記的抗體應被吸附，避免其他種類蛋白的交叉反應以減少與這些從流式培養中產生的免疫球蛋白的結合。這些種類的蛋白存在于細胞表面或組織中，或額外加入的作為第一抗體和其他第二抗體的蛋白。交在多重標記過程中，通過使用來源于一個單個寄主個體的已標記抗體，多功能第一抗體和第二抗體的交叉反應也可以被吸附，以避免和其他寄主個體進行交叉反應來減少背景影響。