脾細(xì)胞
1．材料
(1) 免疫過(guò)的血清抗體滴度高的Balb/c鼠。
(2) 1640培養(yǎng)液
(3) 2.5％FCS－1640營(yíng)養(yǎng)液
2．操作方法
(1) 拉頸或用CO2處死小白鼠。
(2) 將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無(wú)菌條件下取脾。
(3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。
(4) 用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細(xì)胞懸液，用毛細(xì)管將懸液移入小試管中。
(5) 直立小試管3min，使大塊的結(jié)締組織下沉，把細(xì)胞懸液移入離心管中。
(6) 以2.5％FCS—1640充滿(mǎn)離心管，并以400g離心7min～10min（與此同時(shí)應(yīng)開(kāi)始制備骨髓細(xì)胞）。
(7) 把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。
(8) 重復(fù)⑹、⑺步驟。
(9) 計(jì)算細(xì)胞，以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格。
骨髓瘤細(xì)胞
骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細(xì)胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞。
選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件：①該瘤細(xì)胞系的來(lái)源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；②骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài)，不產(chǎn)生γ球蛋白或不分泌到細(xì)胞外；③骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)較高的細(xì)胞密度,最好106個(gè)細(xì)胞/ml；④生長(zhǎng)速度快，繁殖時(shí)間短。
目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（簡(jiǎn)稱(chēng)SP2）；③P2—X？ —Ag8·6·5·3（簡(jiǎn)稱(chēng)653）；④FO
以653最為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）誘發(fā)出來(lái)的一種漿細(xì)胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并經(jīng)過(guò)培育形成一株8-氮鳥(niǎo)嘌呤有抵抗力的亞系。
骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，試驗(yàn)時(shí)復(fù)蘇、增殖、傳代即可。
由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落，因此不需要胰酶處理。為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，在融合前，可將培養(yǎng)基內(nèi)加入15μg/ml 8－氮鳥(niǎo)嘌呤。取約1×107～6×107對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（即培養(yǎng)15h～20h）的骨髓瘤細(xì)胞，在室溫離心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再懸浮并計(jì)數(shù)。
飼養(yǎng)細(xì)胞
在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長(zhǎng)繁殖，加入的細(xì)胞稱(chēng)之為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cell）。在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過(guò)程中，就是在少量的或單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生長(zhǎng)繁殖成群體，因此在這一過(guò)程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞。許多種類(lèi)的動(dòng)物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞，如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì)胞等，常選用腹腔滲出細(xì)胞，其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞，另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，為融合細(xì)胞的生長(zhǎng)造成良好的環(huán)境。腹腔細(xì)胞的來(lái)源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠。也可以是其他種類(lèi)的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。
1．材料
（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。
（2）11.6％蔗糖溶液（經(jīng)10磅30min高壓滅菌）。
2．操作方法
（1）拉頸處死小鼠。
（2）70％酒精浸泡消毒10min。
（3）用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開(kāi)一小口，剝開(kāi)皮膚，露出腹腔。
（4）用注射器將4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管。
（5）1 000r／min離心10min。
（6）取上清，以HAT選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，使每毫升含40萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞。
（7）以1ml吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)皿，每孔0.05ml，含2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即可供細(xì)胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少，則可以在細(xì)胞換液時(shí)再加入一些。