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生物芯片雜交

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-07-06

待分析基因在與芯片結合探針雜交之前必需進行分離、擴增及標記。根據樣品來源、基因含量及檢測方法和分析目的不同,采用的基因分離、擴增及標記方法各異。當然,常規的基因分離、擴增及標記技術完全可以采用,但操作繁瑣且費時。高度集成的微型樣品處理系統如細胞分離芯片及基因擴增芯片等是實現上述目的的有效手段和發展方向。為了獲得基因的雜交信號必須對目的基因進行標記,目前采用的最普遍的熒光標記方法與傳統方法如體外轉錄、PCR、逆轉錄等原理上并無多大差異,只是采用的熒光素種類更多,這可以滿足不同來源樣品的平行分析。用計算機控制的高分辨熒光掃描儀可獲得結合于芯片上目的基因的熒光信號,通過計算機處理即可給出目的基因的結構或表達信息。

雜交條件的選擇與研究目的有關,多態性分析或者基因測序時,每個核苷酸或突變位點都必須檢測出來。通常設計出一套四種寡聚核苷酸,在靶序列上跨越每個位點,只在中央位點堿基有所不同,根據每套探針在某一特點位點的雜交嚴謹程度,即可測定出該堿基的種類。如果芯片僅用于檢測基因表達,只需設計出針對基因中的特定區域的幾套寡聚核苷酸即可。表達檢測需要長的雜交時間,更高的嚴謹性,更高的樣品濃度和低溫度,這有利于增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度。突變檢測,要鑒別出單堿基錯配,需要更高的雜交嚴謹性和更短的時間。

此外,雜交反應還必須考慮雜交反應體系中鹽濃度、探針GC含量和所帶電荷、探針與芯片之間連接臂的長度及種類、檢測基因的二級結構的影響。有資料顯示探針和芯片之間適當長度的連接臂可使雜交效率提高150倍[9]。連接臂上任何正或負電荷都將減少雜交效率。由于探針和檢測基因均帶負電荷,因此影響他們之間的雜交結合,為此有人提出用不帶電荷的肽核酸(PNA)做探針[9]。雖然PNA的制備比較復雜,但與DNA探針比較有許多特點,如不需要鹽離子,因此可防止檢測基因二級結構的形成及自身復性。由于PNA-DNA結合更加穩定和特異,因此更有利于單堿基錯配基因的檢測。

 

 
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