為了滿足實時PCR更高敏感性要求，各試劑公司都致力于開發(fā)新型的化學(xué)發(fā)光材料，目前作為商業(yè)用途的這些化學(xué)物質(zhì)都能適用于上述的各種儀器。它們主要有以下幾種：
1. 水解探針或Taqman探針：這種探針用于Taqman分析法，它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’à3’活性所降解，探針的5’端有一熒光報告基團，3’端有一熒光淬滅基團，當(dāng)兩個基團相互先靠近的時候，由于發(fā)生能量傳遞作用，報告基團不能發(fā)出熒光，但隨著擴增反應(yīng)的進行，5’端的報告基團隨著探針的水解而脫落下來，不再與淬滅發(fā)生能量傳遞作用，從而能發(fā)出熒光，被信號探測器所捕獲。常同探針5’端相結(jié)合的基團有FAM（6－羧基熒光素）,TET（四氯－6－羧基熒光素）,JOE（2，7－二甲基－4，5－二氯－6－羧基熒光素），HEX（六氯－6－甲基熒光素）或VIC，常與3’端相結(jié)合的熒光淬滅基團常為TAMRA (6- 羧基四甲基若丹明)或DABCYL（4-（4’-惡烷氨基苯偶氮）苯甲酸）。相較之于TAMRA，使用DABCYL可以更有效的減少自發(fā)熒光信號[6]。目前，水解探針已被用于基因檢測、病毒定量、癌細胞基因微突變檢測、細胞因子基因定量等，其結(jié)果都具有高特異性與高敏感性。
2. 分子信標(biāo): 是一種單鏈DNA形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在其一端有一報告基團，在另一端有一淬滅基團[18]，當(dāng)它形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，由于熒光報告基團與淬滅基團想互靠近，兩者之間發(fā)生熒光信號能量共振轉(zhuǎn)移（fluorescent resonance energy transfer FRET），當(dāng)熱循環(huán)溫度達到分子beacon的解鏈溫度時，其構(gòu)象發(fā)生改變，能與模板結(jié)合而完全伸展成線性分子，使得FRET消失，報告基團發(fā)出熒光信號。分子信標(biāo)特別適用于檢測點突變，這能區(qū)分只有一個核苷酸差異的不同DNA序列，而且其敏感性要遠比同等長度的寡核苷酸探針高，分子beacon已被用于
突變檢測、病原體定量、病毒檢測和胚胎的性別判斷，它同時出用于多重PCR檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒。
3. scorpions: 它由兩個寡核苷酸分子組成，一個是引物，另一個是帶熒光分子的探針，但是此探針也具有引物的功能。引物與形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針相連，在探針上由于熒光報告基團與淬滅基團相互靠近，不能發(fā)射熒光。在反應(yīng)的變性階段，探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)會解開，構(gòu)象發(fā)生改變，在退火時則與模板相結(jié)合，形成線性分子，報告基團同淬滅基團分離而發(fā)射熒光。同Taqman探針和分子beacon相比，scorpion能更快地發(fā)射出熒光且信號更為強烈[31]，其特異性也很高，因為只有在反應(yīng)體系中存在特異的目的基因，探針-引物才會與之相結(jié)合。Scorpion是一種較新的熒光材料，具有良好的應(yīng)用前景。
4. 雜交探針：該材料使用四個寡聚核苷酸分子，兩個引物與兩個探針，雜交探針分別單標(biāo)，一個攜帶熒光供體基團，一個攜帶熒光受體基團，當(dāng)這兩個探針雜交到目的基因上時，能形成首尾相連的結(jié)構(gòu)使兩個熒光基團相互靠近，發(fā)生FRET。受體基團能轉(zhuǎn)移能量，使得供體基團在不同波長條件下被激發(fā)，發(fā)射出的熒光量直接與目的基因的產(chǎn)量成相關(guān)關(guān)系。這一方法已被Roche公司生產(chǎn)的Lightcycler所應(yīng)用，進行病原體檢測、病毒荷載量的測定等領(lǐng)域。
5. SYBR Green I: 這是一種DNA結(jié)合染料，能非特異地?fù)饺氲诫p鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結(jié)合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光。它的最大優(yōu)點就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應(yīng)體系中，從經(jīng)濟角度考慮，它也比其它的探針的價格要便宜得多，但由于它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，所以一旦反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異擴增，那它就會影響到定量結(jié)果的可靠性與重復(fù)性。要避免這種不利因素，一方面可以通過Lightcycler和Rotor gene、Smart gene等熱循環(huán)儀內(nèi)設(shè)定的程序過對擴增曲線進行分析，以區(qū)分由PCR產(chǎn)物和本底造成的熒光信號，另一方面就是選擇良好的引物和探針并優(yōu)化反應(yīng)條件以消除非特異性影響。
