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如何去除融解曲線的雜峰

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-09-02  來(lái)源:上海炎熙生物科技有限公司
核心提示:① 引物:如果引物設(shè)計(jì)不優(yōu),如引物設(shè)計(jì)軟件得出的引物評(píng)分較低、引物擴(kuò)增效率不滿足90-110%,主要原因可能是引物本身質(zhì)量不佳導(dǎo)

① 引物:如果引物設(shè)計(jì)不優(yōu),如引物設(shè)計(jì)軟件得出的引物評(píng)分較低、引物擴(kuò)增效率不滿足90-110%,主要原因可能是引物本身質(zhì)量不佳導(dǎo)致體系出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

解決方案:

重新設(shè)計(jì)引物,選擇引物設(shè)計(jì)軟件評(píng)分較高的2-3對(duì)引物進(jìn)行合成,之后選擇融解曲線無(wú)雜峰,擴(kuò)增效率滿足90-110%,且更接近100%的引物作為該基因的引物。

若該雜峰為引物二聚體引起,適當(dāng)降低引物的投入量可以有效抑制引物二聚體的產(chǎn)生。

② 模板:cDNA模板存在基因組污染。

解決方案:

設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物進(jìn)而避免基因組污染帶來(lái)的干擾;或者選用帶有基因組清除的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄前對(duì)RNA中混有的基因組進(jìn)行清除。

③ CT值偏大:CT值≥30,可能是由于基因本身表達(dá)量低、或者擴(kuò)增效率不滿足90-110%而導(dǎo)致的基因CT值偏大。CT值較大的情況下,融解曲線容易出現(xiàn)雜峰。

編輯:songjiajie2010

 
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