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干貨分享:細胞ROS是什么?如何檢測?

放大字體  縮小字體 發布日期:2024-09-23  來源:細胞鏟屎官公眾號
核心提示:眾所周知,ROS在細胞生命,應激和死亡中具介導作用,今天來聊下ROS。ROS也叫活性氧(reactive oxygen species)是細胞內產生的一

眾所周知,ROS在細胞生命,應激和死亡中具介導作用,今天來聊下ROS。

ROS也叫活性氧(reactive oxygen species是細胞內產生的一種具有氧化活性的化學物質,包括過氧化氫、超氧陰離子等。ROS在正常生理條件下也會產生,但當其產生過多或清除不足時,會對細胞造成氧化應激,導致細胞損傷和疾病發生。

檢測方法

目前有多種方法用于檢測ROS,包括熒光染色法、電子順磁共振技術(EPR)、化學發光法、色譜法、分光光度法、電化學生物傳感器以及基于熒光蛋白等七種。在這里,我們將著重介紹熒光染色法,以及其在檢測細胞內ROS時的原理和操作步驟。

檢測原理

目前,用于檢測細胞內ROS最廣泛采用的方法是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA(二氯熒光黃雙乙酸鹽)是一種可指示的探針,其本身不具有熒光,但可以自由穿過細胞膜。一旦進入細胞,它會被細胞內的酯酶水解成DCFH。由于DCFH無法穿過細胞膜,因此熒光探針會在細胞內積聚。細胞內的ROS能夠氧化無熒光的DCFH,生成有熒光的DCF,且熒光強度與ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡、流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設備,在最大激發波長480nm和最大發射波長525nm下檢測熒光信號。

檢測步驟:

1. 裝載探針

對于刺激時間較短(通常為2小時以內)的細胞,先裝載探針,后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長(通常為6小時以上)的細胞,先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞,后裝載探針。
原位裝載探針:本方法僅適用于貼壁培養細胞。按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10微摩爾/升。去除細胞培養液,加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜,通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃細胞培養箱內孵育20分鐘。用無血清細胞培養液洗滌細胞三次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。通常活性氧陽性對照在刺激細胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細胞后裝載探針:按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10微摩爾/升。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中,細胞濃度為一百萬至二千萬/毫升,37℃細胞培養箱內孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下,使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養液洗滌細胞三次,以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞,或把細胞等分成若干份后刺激細胞。通常活性氧陽性對照在刺激細胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
說明:僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照,其余孔不必加入Rosup。

2. 檢測

對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察,或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。對于收集細胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測,用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以

注意事項

1、在完成探針裝載后,務必充分清洗,去除未進入細胞的探針殘余,以避免引發高背景信號。
2、探針裝載和清洗完成后,可執行激發波長和發射波長的掃描,確保探針裝載狀況良好。
3、為降低各類誤差,建議盡量縮短探針裝載后至測定時的時間(刺激時間除外)。

 

編輯:songjiajie2010

 
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