激光掃描共聚焦顯微鏡可測定的樣品種類很多．包括生物材料、組織(切片)、細胞(亞細胞)結(jié)構(gòu)等。樣品中熒光的來源主要有如下幾種：自發(fā)熒光(autofluorescence)、熒光染色、免疫熒光、熒光蛋白、誘發(fā)熒光(induced fluorescence)及酶致熒光(enzymatically produced fluorescence)等等。其中大部分熒光素的激發(fā)和發(fā)射波長均可在儀器自帶軟件的染料信息庫中找到。

 

1．觀察步驟及儀器操作  根據(jù)實驗要求制備樣品完畢后。即可進行觀察。基本步驟如下：

 

(1)開啟儀器電源及光源：一般先開啟顯微鏡和激光器，再啟動計算機，然后啟動操作軟件，設(shè)置熒光樣品的激發(fā)光波長，選擇相應(yīng)的濾光鏡組塊。以便光電倍增管(photo multiplier tube，PMT)檢測器能得到足夠的信號結(jié)果。使用汞燈的注意事項同普通熒光顯微鏡。

 

(2)設(shè)置相應(yīng)的掃描方式：在目視模式下．調(diào)整所用物鏡放大倍數(shù)，在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細胞。切換到掃描模式，調(diào)整雙孔針和激光強度參數(shù)，即可得到清晰的共聚焦圖像。

 

(3)獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結(jié)果即可。

 

(4)關(guān)閉儀器：儀器測定樣品結(jié)束后，先關(guān)閉激光器部分，計算機仍可繼續(xù)進行圖像和數(shù)據(jù)處理。若要退出整個激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)．則應(yīng)該在激光器關(guān)閉后，待其冷卻至少10分鐘后再關(guān)閉計算機及總開關(guān)。

 

2．獲取三維圖像  激光掃描共聚焦顯微鏡具有細胞“CT”功能，因此，它可以在不損傷細胞的情況下，獲得一系列光學切片圖像。選用“Z-Stack"模式，即可實現(xiàn)此項功能。其基本步驟是：

 

①開啟“Z-Stack”選項；

 

②確定光學切片的位置及層數(shù)；

 

③啟動“Start”，獲得三維圖像。

 

3．獲取時間序列圖像  共聚焦顯微鏡的"Time-Series"功能，可以自動在實驗者規(guī)定的時間內(nèi)按照設(shè)定的時間間隔獲取圖像。只需設(shè)定所需的時間間隔以及所需圖像數(shù)量，開啟“Start T”功能鍵，即可進行實驗。“Time-Series"功能大大減輕了實驗者的勞動強度，對于熒光漂白恢復(fù)和鈣離子成像等實驗非常實用。

 

4．注意事項及維護保養(yǎng)

 

(1)儀器周圍要遠離電磁輻射源；

 

(2)環(huán)境無震動，無強烈的空氣擾動；

 

(3)室內(nèi)具有遮光系統(tǒng)，保證熒光樣品不會被外源光漂白；

 

(4)環(huán)境清潔；

 

(5)控制工作溫度在5～25℃。