一、簡(jiǎn)介

X-Gal在β-半乳糖苷酶的催化下水解后呈藍(lán)色，因此常用于轉(zhuǎn)基因篩選試驗(yàn)中，如藍(lán)白斑篩選或β-半乳糖苷酶的原位染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。藍(lán)白斑試驗(yàn)中主要根據(jù)菌落呈現(xiàn)的顏色即可簡(jiǎn)單的挑選出哪些是轉(zhuǎn)化子。

 

分子 式為C14H15BrClNO6，分子量為408.63，CAS Number 7240-90-6。

X–Gal是β–半乳糖苷酶(β–galactosidase)的底物，水解后呈藍(lán)色。基于這個(gè)特點(diǎn)，pUC系列載體DNA(或其他帶有l(wèi)acZ 基因載體DNA)以lacZ 缺失細(xì)胞為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)、或用M13噬菌體載體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，如果在平板培養(yǎng)基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互補(bǔ)性，可以根據(jù)是否呈現(xiàn)白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑選出基因重組 體。

二、使用方法 ：

首先把X-Gal配制成20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(-20℃避光保存)，然后在100 ml的瓊脂培養(yǎng)基中，加入200 μl的上述溶液、100 μl的IPTG(24 mg/ml)和100 μl的Amp(100 mg/ml)，制作成X-Gal、IPTG、Amp平板培養(yǎng)基。當(dāng)DNA片段插入至pUC系列載體(或其他帶有l(wèi)acZ、Amp基因載體)，然后轉(zhuǎn)化至lacZ缺失細(xì)胞中后，涂布上述的X–Gal、IPTG、Amp平板培養(yǎng)基，可根據(jù)長(zhǎng)出菌體的藍(lán)白色，而方便地挑選出基因重組 體(白色為具有DNA插入片段的基因重組體)。

三、注意事項(xiàng) ：

1、培養(yǎng)噬菌體時(shí)，Top agar中的添加量為：50 μl/3 ml(20mg/ml)。

2、含有X-Gal的培養(yǎng)基4℃避光保存，須在1~2周內(nèi)使用。

四、IPTG-X-gal 平板制作

1、IPTG儲(chǔ)液配置：一般將IPTG配成20%(m/V)(約0.84M)的母液。稱取0.5克 IPTG粉末，用2 ml蒸餾水將其完全溶解后，補(bǔ)加蒸餾水至2.5ml，用孔徑0.22 μm的小型注射型過濾器 (預(yù)先裝好濾膜滅菌備用)過濾除菌，-20 ℃凍存。

2、X-gal儲(chǔ)液配置：用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。稱取0.2克X-gal，加入10ml二甲基甲酰胺(DMF)，溶解后保存于一小血清瓶?jī)?nèi)，裝有X-gal溶液的血清瓶須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應(yīng)貯存于-20℃。X-gal溶液無須過濾除菌。

3、IPTG-X-gal平板制備：在含氨芐或卡那抗生素平板上，滴加40 µL的X-gal儲(chǔ)液及5 µL的IPTG儲(chǔ)液(怕體積過小影響涂布均勻，可適當(dāng)稀釋后再涂布)，涂布均勻后晾干后使用。在臨使用前提前1h制備。

注：為方便實(shí)驗(yàn)操作，試驗(yàn)中也可以將X-gal和IPTG的儲(chǔ)備液按照菌液體積和平板數(shù)量計(jì)算好濃度，直接加入到準(zhǔn)備用于涂平板的細(xì)菌 培養(yǎng)液中，混勻后即可涂平板，這樣可以節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間。若經(jīng)過培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌落藍(lán)白斑顯示的不夠明顯，可以將平板放入4度冰箱里，過一段時(shí)間以后菌落的藍(lán)白斑就顯示的比較清晰了。