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微生物分離--雙層平板法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2024-06-14
核心提示: 一、定義雙層平板法,又叫雙層瓊脂平板法,顧名思義,兩層固體培養(yǎng)基的平板,具體是指由一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)倒入底層固體培養(yǎng)基和
 一、定義
雙層平板法,又叫雙層瓊脂平板法,顧名思義,兩層固體培養(yǎng)基的平板,具體是指由一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)倒入底層固體培養(yǎng)基和上層固體培養(yǎng)基形成的雙層平板,進(jìn)行檢測(cè)噬菌體或其他抗性的過程就叫雙層平板法。

二、原理

先在培養(yǎng)皿中倒入底層固體培養(yǎng)基,待其凝固后倒入含有檢測(cè)菌的上層培養(yǎng)基,經(jīng)培養(yǎng)后,上層培養(yǎng)基會(huì)發(fā)生變化,比如說出現(xiàn)噬菌斑或抑菌圈或其他,以此來計(jì)算噬菌斑的數(shù)量,測(cè)定抗生素效價(jià)等。

三、雙層平板法的應(yīng)用1-噬菌體的分離培養(yǎng)

1.試驗(yàn)詳細(xì)操作步驟

(1)配制底層培養(yǎng)基和上層培養(yǎng)基

底層培養(yǎng)基瓊脂粉含量:1.5%-2%。

底層培養(yǎng)基培養(yǎng)基:無菌水加1.5%-2%瓊脂粉,滅菌,待冷卻至50℃倒平板,凝固后備用

上層培養(yǎng)基瓊脂粉含量:1%。

上層培養(yǎng)基培養(yǎng)基:根據(jù)檢測(cè)菌種進(jìn)行確定,滅菌后放入水浴鍋中,備用。比如說,檢測(cè)噬菌體,可以選用LB固體培養(yǎng)基。

(2)傾倒上層培養(yǎng)基

一般情況,待測(cè)樣品為噬菌體污染的樣品。

①取培養(yǎng)基:取出上層培養(yǎng)基,冷卻至45℃左右。

②取樣品:用移液器樣品0.5mL放入上層培養(yǎng)基中。

③取試驗(yàn)菌:接著用移液器吸取大腸桿菌菌液0.2mL,也放入上層培養(yǎng)基中,沿壁搖勻。

④傾倒平板:將上述混合液快速倒入底層培養(yǎng)基上面,凝固。

(3)培養(yǎng)

上層培養(yǎng)基凝固后,放置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。

(4)觀察,計(jì)算。

2.操作技巧:

(1)底層培養(yǎng)基不宜太厚,覆蓋培養(yǎng)皿底部即可。

太厚上層培養(yǎng)基無法倒入,太薄不能覆蓋培養(yǎng)皿底部,起不到應(yīng)有的作用。

(2)上層培養(yǎng)基滅菌完成后,要搖勻放入水浴鍋中,間隔沿壁搖動(dòng)。

經(jīng)常搖動(dòng),培養(yǎng)基不容易出現(xiàn)結(jié)塊。

(3)水浴鍋溫度調(diào)至60℃,溫度不宜太高或太低。

溫度太高,想用的時(shí)候冷卻較慢;溫度太低,凝固的又太快。

(4)上層培養(yǎng)基溫度降至45℃左右,再加入污染菌液和試驗(yàn)菌。

這個(gè)溫度既能保證培養(yǎng)基和菌液混勻,又能保證不凝固不結(jié)塊。

(5)上層培養(yǎng)基要沿壁搖勻,盡量避免產(chǎn)生氣泡。

氣泡太多,噬菌斑鋸齒狀,很難看。

(6)控制好試驗(yàn)菌濃度。一般正好覆蓋一層菌液為好。

3.注意事項(xiàng):

(1)酒精燈旁邊操作,時(shí)刻保持無菌意識(shí)。

(2)雙層平板法相對(duì)厚度不易把握,一定要看準(zhǔn),不能溢出或太厚。

(3)試驗(yàn)結(jié)束一定要將無關(guān)物品從超凈工作臺(tái)中取出,該滅菌的物品一定要滅菌后再處理,避免交叉污染。
(4)試驗(yàn)過程中,盡量減少人員流動(dòng)。

編輯:songjiajie2010

 
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