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重組蛋白純化的基本策略

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28
純化問題所涉及的具體步驟最終取決于樣品的性質(zhì)。但也有共同可參考的階段
捕獲階段:目標(biāo)是澄清、濃縮和穩(wěn)定目標(biāo)蛋白。
中度純化階段:目標(biāo)是除去大多數(shù)大量雜質(zhì),如其它蛋白、核酸、內(nèi)毒素和病毒等。
精制階段:除去殘余的痕量雜質(zhì)和必須去除的雜質(zhì)。
分離方法的選擇
根據(jù)蛋白質(zhì)的特殊性質(zhì)采用不同的分離方法:
蛋白質(zhì)的性質(zhì)
方法
電荷(等電點(diǎn))
離子交換(IEX)
分子量
凝膠過濾(GF)
疏水性
疏水(HIC)反相(RPC)
特異性結(jié)合
親和(AC)

 

 

 

 

每一種方法都有分辨率、處理量、速度和回收率之間的平衡。
分辨率:由選擇的方法和層析介質(zhì)生成窄峰的能力來實(shí)現(xiàn)。總的來說,當(dāng)雜質(zhì)和目標(biāo)蛋白性質(zhì)相似時(shí),在純化的最后階段分辨率是重要因素。
處理量:一般指在純化過程中目標(biāo)蛋白的上樣量。如上樣體積、濃度等。
速度:在初純化中是重要因素,此時(shí)雜質(zhì)如蛋白酶必須盡快除去。
回收率:隨著純化的進(jìn)行漸趨重要,因?yàn)榧兓a(chǎn)物的價(jià)值在增加。
在三階段純化策略中每一種方法的適用性見下表:

技術(shù)
主要特點(diǎn)
捕獲
中度純化
精制
樣品起始狀態(tài)
樣品最終狀態(tài)
IEX
高分辨率
高容量
高速度
★★★
★★★
★★★
低離子強(qiáng)度
樣品體積不限
高離子強(qiáng)度或pH改變。
樣品濃縮
HIC
分辨率好
容量好
高速度
★★
★★★
高離子強(qiáng)度
樣品體積不限
低離子強(qiáng)度
樣品濃縮
AC
高分辨率
高容量
高速度
★★★
★★★
★★
結(jié)合條件特殊
樣品體積不限
洗脫條件特殊
樣品濃縮
GF
高分辨率
(使用Supedex)
★★★
樣品體積(<總柱體積的5%)和流速范圍有限制
緩沖液更換(如果需要)
樣品稀釋
RPC
高分辨率
★★★
需要有機(jī)溶劑
在有機(jī)溶劑中,有損失生物活性的風(fēng)險(xiǎn)

 
提示:
1、 通過組和各種方法使純化步驟之間的樣品處理減至最少,以避免需要調(diào)節(jié)樣品。第一個(gè)步驟的產(chǎn)物的洗脫條件應(yīng)適宜于下一個(gè)步驟的起始條件。
2、 硫酸銨沉淀是常用的樣品澄清和濃縮方法,所以HIC是捕獲階段的理想方法。
3、 GF很適宜在由濃縮效應(yīng)的方法(IEX、 HIC、 AC)后使用,凝膠過濾對上樣體積有限制,但不受緩沖液條件的影響。
4、 在捕獲階段選擇對目標(biāo)蛋白具有最高選擇性或/和處理量的方法
5、 如果對目標(biāo)蛋白的性質(zhì)了解甚少的情況下,可采用IEX-HIC-GF的方法組合作為標(biāo)準(zhǔn)方案。
6、 只要目標(biāo)蛋白耐受的情況下,可以考慮采用RPC方法用于精制階段。
注:應(yīng)該指出,三階段純化策略不是說所有的策略都必須是三個(gè)純化步驟。所用的步驟數(shù)目取決于純度要求和蛋白的最終用途。
附:純化工藝路線

 

 
鏇村

 

 
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